生化試劑應(yīng)用常見問題的探討

試劑空白吸光度是反映試劑質(zhì)量的指標(biāo)之一，但不能反映試劑質(zhì)量的全部。試劑成份、純度、用量及穩(wěn)定性，才是保證試劑質(zhì)量的關(guān)鍵所在。目前市售的一些試劑具有抗干擾作用，主要是通過加入抗干擾物質(zhì)或使用新的色素原以避免內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。但值得注意的是：一些試驗(yàn)項(xiàng)目在消除內(nèi)源性物質(zhì)干擾的同時，會帶來樣品含量真實(shí)性的變化。
1 試劑空白
試劑空白吸光度是反映試劑質(zhì)量的指標(biāo)之一。每種試劑都有一定的空白吸光度范圍，試劑空白吸光度的改變往往提示該試劑的變質(zhì)；如利用Trinder反應(yīng)為原理的檢測試劑會因含酚類物質(zhì)被氧化為醌而變?yōu)榧t色。堿性磷酸酶、r一谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、淀粉酶等檢測試劑會因基質(zhì)分解出硝基酚或酚基苯胺而變黃。有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等負(fù)反應(yīng)，在放置過程中其試劑空白吸光度會因NADH自行氧化為NAD+而下降。原則上，吸光度上升的反應(yīng)，其試劑空白吸光度越低越好，不能超過一個高限；相反，吸光度下降的反應(yīng)，其試劑空白吸光度不能低于一個低限。因此，試劑空白吸光度限值，常作為程序參數(shù)輸入儀器，如經(jīng)核查超限，儀器會自動報警，提示更換試劑。需要指出的是，還原型輔酶I（或II）等投料量不足或劣質(zhì)的原料，往往需要加大用量，才使“表觀”吸光度上升，湊合過試劑空白核對的“關(guān)”，其后果為如下情況：
1．1 線性范圍變窄 現(xiàn)象：高值測不高。原因：生產(chǎn)試劑時有效成分投料量不足；試劑成份穩(wěn)定性較差。
1．2 靈敏度變低現(xiàn)象：酶促反應(yīng)速度曲線斜率下降，測定結(jié)果有嚴(yán)重系統(tǒng)誤差。原因：試劑底物濃度不足。
1．3 低值偏高 現(xiàn)象：試劑空白的變化曲線（吸光度VS時間）明顯波動。原因：試劑自身不穩(wěn)定，自行分解；工具酶純度
不夠，雜酶含量超限，導(dǎo)致干擾作用。
2 樣品信息
樣品的溶血、脂血、黃疸等會對測定結(jié)果產(chǎn)生非化學(xué)反應(yīng)的干擾。因此，應(yīng)根據(jù)溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，采用雙波長或多波長的檢測模式，并在結(jié)果計算中扣除因溶血、脂血、黃疸引起的影響，減少干擾程度。
3 測定范圍
每種待測物都有一個可測定的濃度或活性范圍，樣品結(jié)果若超過此范圍，分析儀將顯示結(jié)果超過范圍的提示。表示試劑已經(jīng)變質(zhì)，應(yīng)更換合格試劑。
4 底物耗盡
使用連續(xù)監(jiān)測法、兩點(diǎn)法測定酶活性時，若酶活性非常高，底物接近被耗盡，吸光度上升或下降會超過某一吸光度變化范圍，監(jiān)測期的吸光度將偏離線性，使測定結(jié)果不可靠。
5 酶的預(yù)活化
測定血清中的某些酶，如CK，離體（采血）后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巰基（一SH）被氧化造成的。只有通過適當(dāng)?shù)倪€原作用才能重新激活。如CK—NAC試劑盒即含有CK活化劑，名為N一乙酰半胱氨酸。實(shí)驗(yàn)研究證明，NAC對血清中已失活的CK活化過程約需180 S。這就是CK測定為什么要延遲時間較長的理論依據(jù)。在AST，ALT采用IFCC推薦方法測定時需要磷酸吡哆醛預(yù)活化。需要強(qiáng)調(diào)：含有活化劑的生化試劑，其測定酶活性的結(jié)果要高些。
6 校準(zhǔn)與結(jié)果溯源性
酶的校正：要滿足在同一方法學(xué)、同一測定條件、與理論計算的FACTOR值差異不大，沒有發(fā)現(xiàn)有明顯影響因素，方可
進(jìn)行校正。
檢驗(yàn)結(jié)果溯源性，得建立一個可靠的參考系統(tǒng)作為準(zhǔn)確性基礎(chǔ)，然后將準(zhǔn)確性轉(zhuǎn)移到常規(guī)方法測定中去，使常規(guī)方法測定結(jié)果可溯源到參考系統(tǒng)所提供的準(zhǔn)確性基礎(chǔ)上來。在實(shí)現(xiàn)溯源性目標(biāo)過程中，永遠(yuǎn)以患者新鮮標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)對象，以方法學(xué)對比試驗(yàn)方法為驗(yàn)證手段。方法學(xué)對比試驗(yàn)常采用回歸方程進(jìn)行統(tǒng)計分析，假如斜率接近1，截距較小，這意味著實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法對標(biāo)本測定結(jié)果和溯源目標(biāo)參考系統(tǒng)對標(biāo)本檢測結(jié)果非常接近。
臨床化學(xué)中參考標(biāo)準(zhǔn)（二級標(biāo)準(zhǔn)）要有通用性，但生產(chǎn)廠家提供的校準(zhǔn)液并非通用的，只適用于某一特定的分析系統(tǒng)。
校準(zhǔn)液標(biāo)示值往往是按其基質(zhì)偏差修正的，所以標(biāo)示值并非實(shí)際值。校準(zhǔn)液、質(zhì)控血清通常是經(jīng)過處理的混合人或動物血清，這種制備物在特定分析系統(tǒng)中往往與人新鮮血清反應(yīng)性不同而產(chǎn)生基質(zhì)偏差。如總膽固醇測定基質(zhì)效應(yīng)研究指出：校準(zhǔn)液酶法測定回收結(jié)果偏低可達(dá)5%~7%。
7 試劑抗干擾作用的合理性有些液體雙試劑，其實(shí)質(zhì)并不真正具備抗干擾的能力而只是解決了試劑的液體化和穩(wěn)定性問題。如，ALT試劑盒中，NADH在pH7.5~7.8水溶液中極不穩(wěn)定，在pH>8.7時才能穩(wěn)定保存。因此，為了保證試劑穩(wěn)定性，液體雙試劑的R1需要維持pH>8.7，但此時LDH活性大大下降，就失去消除內(nèi)源性丙酮酸的功能，只有加入試劑R2后，反應(yīng)混合液的pH下降至LDHzui適pH，在經(jīng)過延遲時間60 S后，才能消除內(nèi)源性丙酮酸的干擾。再如，Tfinder反應(yīng)中抗Vc干擾問題：由于維生素c易氧化，樣品中Vc會競爭反應(yīng)生成的*，而產(chǎn)生負(fù)干擾。因此，在試劑R1中加入抗壞血酸氧化酶，這種方法是有效的，但不一定有很大的意義。因?yàn)閂c干擾必須同時具備二個條件：a）Vc攝入量較多；b）采血后立即測定。實(shí)驗(yàn)表明離體血清中Vc在90 min后會全部被氧化。又如，使用胺類新色原。a）分子共軛結(jié)構(gòu)特性使得靈敏度提高，相應(yīng)可以減少樣本用量，zui終能有效地降低干擾物的量．b）使生成胺類色素原zui大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上，以避開黃疸、溶血干擾。如：亞鐵氰化鉀一H 0 ，能有效避免黃疸干擾的理論依據(jù)是亞鐵氰化鉀與H。0。親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于膽紅素。
甘油三酯測定，有人主張選用雙試劑方法消除內(nèi)源性甘油，這個方法是可行的，但忽視了一個化學(xué)平衡理論。因?yàn)樗械孽ピ谒芤褐卸疾皇呛唵蔚匾怎サ男问酱嬖冢且运馀c酯化相平衡的形式存在。在一個平衡體系中，如果去除游離甘油，這個平衡就向生成甘油方向移動，甘油三酯就會重新水解，生成新的甘油，達(dá)到新的平衡，因此樣品與R1試劑孵育時間越長，測得甘油三酯值就越低。甘油三酯測定，不僅要去除游離甘油，而且還要克服樣本含量真實(shí)性發(fā)生的變化，試劑中必須加入甘油激酶，并且延遲時間要標(biāo)準(zhǔn)化。所以，一些試驗(yàn)項(xiàng)目在消除內(nèi)源性物質(zhì)干擾的同時，會帶來樣品含量真實(shí)性的變化。